Transcriptome
Correction des tests multiples et volcano
Corriger les p-valeurs pour tests multiples par quatre méthodes, compter les gènes significatifs et tracer un volcano depuis DESeq2 ou edgeR.
Les colonnes sont reconnues par l’en-tête : nom du gène, log2FoldChange et pvalue. Sans en-tête, les trois premières colonnes sont supposées dans cet ordre.
Benjamini-Hochberg contrôle le taux de fausses découvertes et reste le choix conventionnel en RNA-seq. Benjamini-Yekutieli est plus conservateur et valide sous dépendance quelconque entre tests. Bonferroni et Holm contrôlent le risque par famille et sont bien trop stricts sur des dizaines de milliers de gènes. Cet outil ne produit pas de p-valeurs : elles doivent venir de DESeq2, edgeR ou limma.
Formule
p ajustée (BH) = minimum sur tout k ≥ i de (n ÷ k) × p₍ₖ₎
- n
- le nombre total de gènes testés
- k
- le rang du gène après tri croissant des p
- BH
- contrôle le taux de fausses découvertes — le choix conventionnel en RNA-seq
- Bonferroni
- contrôle le risque par famille — une simple multiplication par n
Exemple résolu
Cinq gènes avec des p de 0,01 à 0,05
- p = 0,01 ; 0,02 ; 0,03 ; 0,04 ; 0,05
- n = 5
- Pour chaque rang : p multiplié par n et divisé par le rang, soit 0,05 dans les cinq cas.
- On parcourt du plus grand au plus petit en gardant un minimum courant, pour rester monotone.
- Bonferroni multiplie plutôt chaque p par 5 : de 0,05 à 0,25.
Réponse BH déclare les cinq significatifs au seuil de 0,05 ; Bonferroni en retient un
Erreurs courantes
- Corriger une colonne déjà corrigée. La colonne padj de DESeq2 est déjà passée par BH ; cet outil attend la colonne pvalue brute.
- Employer Bonferroni sur vingt mille gènes. Conçue pour une poignée de tests, la méthode rejette presque tout à l’échelle du transcriptome.
- Filtrer les gènes sur la p brute puis ne corriger que les survivants. Cela casse la garantie sur le taux de fausses découvertes : la correction doit porter sur tous les gènes testés.
- Poser un seuil de log2FC sur des estimations non rétrécies. Pour les gènes peu exprimés, le log2FC brut est bruité ; DESeq2 fournit des valeurs rétrécies bien mieux adaptées au seuillage.
Questions fréquentes
Quelle méthode utiliser ?
Pour le RNA-seq, Benjamini-Hochberg. Pour rester conservateur sans hypothèse sur la dépendance entre tests, Benjamini-Yekutieli. Réservez Bonferroni et Holm à un petit nombre d’hypothèses.
Pourquoi certains gènes DESeq2 n’ont-ils pas de padj ?
À cause du filtrage indépendant : les gènes très faiblement exprimés sont écartés pour donner plus de puissance aux autres. Si vous collez ces lignes ici, elles entreront dans la correction et le résultat divergera de DESeq2.
Axe vertical : p brute ou ajustée ?
Le tracé conventionnel utilise la p brute, la significativité étant portée par la couleur. Choisissez la p ajustée si vous voulez que la ligne de seuil corresponde exactement à votre seuil de décision.