Analyse
qPCR ΔΔCt
Expression relative par la méthode delta delta Ct directement depuis l’export de votre appareil : correspondance automatique des colonnes, correction d’efficacité, propagation de l’erreur des réplicats et graphique en échelle logarithmique.
Données brutes
Paramètres du calcul
Correction d’efficacité d’amplification (méthode de Pfaffl)
À 100 pour cent pour les deux gènes, le résultat vaut exactement 2 puissance moins delta delta Ct. Prenez les efficacités sur la pente de votre propre courbe étalon.
Résultats
L’intervalle indiqué propage l’écart-type des réplicats techniques du gène cible et du gène de référence ; il ne remplace pas un test statistique sur des réplicats biologiques. Votre fichier n’est jamais envoyé — tout est calculé dans le navigateur.
Formule
Fold = 2^(−ΔΔCt)
- ΔCt
- Ct du gène cible moins Ct du gène de référence, dans le même échantillon
- ΔΔCt
- ΔCt de l’échantillon moins ΔCt du calibrateur
- Fold
- expression relative ; un signifie au niveau du calibrateur
- Pfaffl
- si l’efficacité n’est pas de 100 % : rapport = E_cible^ΔCt_cible ÷ E_réf^ΔCt_réf
Exemple résolu
Expression d’IL6 dans un échantillon traité face au contrôle, GAPDH en référence
- Contrôle : GAPDH = 20,0 ; IL6 = 25,0
- Traité : GAPDH = 20,0 ; IL6 = 23,0
- ΔCt contrôle : 25,0 − 20,0 = 5,0
- ΔCt traité : 23,0 − 20,0 = 3,0
- ΔΔCt : 3,0 − 5,0 = −2,0
- Expression relative : 2 puissance plus 2
Réponse une augmentation d’un facteur quatre — le calibrateur vaut toujours exactement un
Erreurs courantes
- Choisir un gène de référence qui répond lui-même au traitement. GAPDH et bêta-actine varient en hypoxie, en différenciation et sous bien des traitements ; validez leur stabilité dans vos conditions.
- Utiliser delta delta Ct alors que les deux gènes n’ont pas la même efficacité. La méthode suppose un doublement par cycle ; si votre courbe étalon dit autre chose, saisissez les efficacités dans la section avancée.
- Présenter des réplicats techniques comme des réplicats biologiques. Trois puits d’un même échantillon mesurent la précision de pipetage, pas la variation réelle entre organismes ou cultures.
- Remplacer Undetermined par zéro. Ce puits signifie que le seuil n’a jamais été franchi ; mettre zéro fausse gravement le résultat. L’outil écarte ces puits.
- Moyenner les variations plutôt que les ΔΔCt. La relation étant exponentielle, l’ordre de ces deux opérations change la réponse.
Questions fréquentes
Comment mesurer l’efficacité d’amplification ?
Faites une série de dilutions d’ADNc et ajustez une courbe étalon. L’efficacité vaut dix puissance moins un sur la pente, moins un. Une pente proche de −3,32 correspond à 100 pour cent.
Combien de gènes de référence faut-il ?
Un travail soigné en utilise au moins deux et prend leur moyenne géométrique. Avec un seul, toute dérive de ce gène passe directement dans le résultat.
Que faire des Ct au-dessus de 35 ?
Le nombre de copies de départ y est très faible et la dispersion entre réplicats augmente. Le seuil de Ct est fixé à 38 par défaut ; abaissez-le si vos données sont bruitées.
Que représente l’intervalle affiché ?
Il propage l’écart-type des réplicats techniques du gène cible et du gène de référence. Il ne remplace pas un test statistique sur des réplicats biologiques et ne doit pas être présenté comme un intervalle de confiance.