Транскриптом
Поправка на множественность и вулкан-график
Поправка p-значений на множественные сравнения четырьмя методами, подсчёт значимых генов и построение вулкан-графика по выводу DESeq2 или edgeR.
Столбцы распознаются по заголовку: имя гена, log2FoldChange и pvalue. Без заголовка первые три столбца берутся в этом порядке.
Метод Бенджамини-Хохберга контролирует долю ложных открытий и является общепринятым для RNA-seq. Бенджамини-Иекутиели консервативнее и справедлив при произвольной зависимости между тестами. Бонферрони и Холм контролируют групповую вероятность ошибки и для десятков тысяч генов чрезмерно строги. Инструмент не вычисляет p-значения: они должны приходить из DESeq2, edgeR или limma.
Формула
скорректированное p (BH) = минимум по всем k ≥ i от (n ÷ k) × p₍ₖ₎
- n
- общее число проверенных генов
- k
- ранг гена после сортировки p по возрастанию
- BH
- контролирует долю ложных открытий — общепринятый выбор для RNA-seq
- Бонферрони
- контролирует групповую вероятность ошибки — простое умножение на n
Разобранный пример
Пять генов с p от 0,01 до 0,05
- p = 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05
- n = 5
- Для каждого ранга: p, умноженное на n и делённое на ранг — 0,05 во всех пяти случаях.
- Идём от наибольшего к наименьшему, беря накопленный минимум, чтобы результат остался монотонным.
- Бонферрони вместо этого умножает каждое p на 5: от 0,05 до 0,25.
Ответ по BH значимы все пять при пороге 0,05, по Бонферрони — один
Частые ошибки
- Корректировать уже скорректированный столбец. Столбец padj из DESeq2 уже прошёл BH; этому инструменту нужен столбец сырых pvalue.
- Применять Бонферрони к двадцати тысячам генов. Метод создан для небольшого числа тестов и в масштабе транскриптома отвергает почти всё.
- Отфильтровать гены по сырому p и корректировать только оставшиеся. Это ломает гарантию по доле ложных открытий: поправка должна охватывать все проверенные гены.
- Ставить порог по log2FC на несжатых оценках. Для генов с малым числом прочтений сырой log2FC шумный; DESeq2 даёт сжатые значения, гораздо более пригодные для порога.
Частые вопросы
Какой метод выбрать?
Для RNA-seq — Бенджамини-Хохберга. Если нужна консервативность без предположений о зависимости между тестами — Бенджамини-Иекутиели. Бонферрони и Холма оставьте для небольшого числа гипотез.
Почему у части генов DESeq2 нет padj?
Из-за независимой фильтрации: гены с очень низкой экспрессией исключаются, чтобы поправка сохранила мощность для остальных. Если подать эти строки сюда, они войдут в поправку и результат разойдётся с DESeq2.
Какую ось брать — сырое p или скорректированное?
Классический график строят по сырому p, а значимость показывают цветом. Скорректированное p выбирайте, если хотите, чтобы линия порога совпадала с порогом принятия решения.