Анализ
qPCR по ΔΔCt
Относительная экспрессия генов методом дельта-дельта Ct прямо из выгрузки прибора: автоматическое сопоставление столбцов, поправка на эффективность, распространение ошибки повторов и график в логарифмическом масштабе.
Исходные данные
Параметры расчёта
Поправка на эффективность амплификации (метод Пфаффля)
При 100 процентах для обоих генов результат в точности равен 2 в степени минус дельта-дельта Ct. Эффективность берите из наклона собственной калибровочной кривой.
Результаты
Указанный диапазон отражает распространение стандартного отклонения технических повторов целевого и референсного генов и не заменяет статистический тест по биологическим повторам. Файл не загружается на сервер — все расчёты идут в браузере.
Формула
Fold = 2^(−ΔΔCt)
- ΔCt
- Ct целевого гена минус Ct референсного в том же образце
- ΔΔCt
- ΔCt образца минус ΔCt калибратора
- Fold
- относительная экспрессия; единица означает уровень калибратора
- Пфаффль
- если эффективность не 100%: отношение = E_цель^ΔCt_цель ÷ E_реф^ΔCt_реф
Разобранный пример
Экспрессия IL6 в обработанном образце относительно контроля, референс GAPDH
- Контроль: GAPDH = 20,0; IL6 = 25,0
- Обработка: GAPDH = 20,0; IL6 = 23,0
- ΔCt контроля: 25,0 − 20,0 = 5,0
- ΔCt обработки: 23,0 − 20,0 = 3,0
- ΔΔCt: 3,0 − 5,0 = −2,0
- Относительная экспрессия: 2 в степени плюс 2
Ответ рост в четыре раза — калибратор всегда равен ровно единице
Частые ошибки
- Выбор референсного гена, который сам реагирует на воздействие. GAPDH и бета-актин меняются при гипоксии, дифференцировке и многих обработках; проверьте стабильность в своих условиях.
- Применение дельта-дельта Ct при разной эффективности двух генов. Метод предполагает удвоение обоих за цикл; если калибровочная кривая говорит иное, введите эффективность в расширенном разделе инструмента.
- Подмена биологических повторов техническими. Три лунки одного образца показывают точность пипетирования, а не различия между организмами или культурами.
- Замена Undetermined нулём. Такая лунка означает, что порог не был пройден; ноль сильно искажает результат. Инструмент такие лунки отбрасывает.
- Усреднение кратностей вместо усреднения ΔΔCt. Зависимость экспоненциальная, поэтому порядок этих операций меняет ответ.
Частые вопросы
Как измерить эффективность амплификации?
Поставьте серию разведений кДНК и постройте калибровочную кривую. Эффективность равна десяти в степени минус один делить на наклон, минус единица. Наклон около −3,32 соответствует 100 процентам.
Сколько нужно референсных генов?
Для аккуратной работы берут не менее двух и используют их среднее геометрическое. С одним референсом любое его колебание напрямую переходит в результат.
Что делать с Ct выше 35?
Там исходное число копий очень мало и разброс между повторами растёт. Порог Ct в инструменте по умолчанию 38; при шумных данных снизьте его.
Что означает показанный диапазон?
Это распространение стандартного отклонения технических повторов целевого и референсного генов. Он не заменяет статистический тест по биологическим повторам и не является доверительным интервалом.