تحلیل داده
qPCR با روش ΔΔCt
تحلیل بیان نسبی ژن با روش دلتا دلتا Ct از روی خروجی خام دستگاه، با نگاشت خودکار ستونها، تصحیح اختیاری بازده تکثیر، انتشار خطای تکرارها و نمودار در مقیاس لگاریتمی.
دادهٔ خام
تنظیم محاسبه
تصحیح بازده تکثیر (روش Pfaffl)
با بازدهٔ ۱۰۰ درصد برای هر دو ژن، نتیجه دقیقاً برابر ۲ به توان منفی ΔΔCt میشود. بازده را از شیب منحنی استاندارد خودتان بهدست بیاورید.
نتایج
بازهٔ گزارششده از انتشار انحراف معیار تکرارهای فنی ژن هدف و ژن مرجع بهدست میآید و جایگزین آزمون آماری روی تکرارهای زیستی نیست. فایل شما آپلود نمیشود و همهچیز در مرورگر محاسبه میشود.
فرمول
Fold = 2^(−ΔΔCt)
- ΔCt
- Ct ژن هدف منهای Ct ژن مرجع، در همان نمونه
- ΔΔCt
- ΔCt نمونه منهای ΔCt نمونهٔ کالیبراتور
- Fold
- بیان نسبی؛ عدد یک یعنی همسطح کالیبراتور
- Pfaffl
- وقتی بازده صد درصد نباشد: نسبت = E_هدف^ΔCt_هدف ÷ E_مرجع^ΔCt_مرجع
مثال حلشده
بیان IL6 در نمونهٔ تیمارشده نسبت به کنترل، با GAPDH بهعنوان ژن مرجع
- کنترل: GAPDH = 20.0 ، IL6 = 25.0
- تیمار: GAPDH = 20.0 ، IL6 = 23.0
- ΔCt کنترل: ۲۵٫۰ − ۲۰٫۰ = ۵٫۰
- ΔCt تیمار: ۲۳٫۰ − ۲۰٫۰ = ۳٫۰
- ΔΔCt: ۳٫۰ − ۵٫۰ = −۲٫۰
- بیان نسبی: ۲ به توان مثبت ۲
پاسخ چهار برابر افزایش بیان — کالیبراتور همیشه دقیقاً یک میشود
خطاهای رایج
- انتخاب ژن مرجعی که خودش با تیمار تغییر میکند. GAPDH و بتا اکتین در هیپوکسی، تمایز و بسیاری از تیمارها ناپایدارند؛ پایداری ژن مرجع را در شرایط خودتان بررسی کنید.
- استفاده از روش دلتا دلتا Ct وقتی بازده دو ژن یکسان نیست. این روش فرض میکند هر دو ژن در هر چرخه دقیقاً دو برابر میشوند؛ اگر منحنی استانداردتان چیز دیگری میگوید، بازده را در بخش پیشرفتهٔ همین ابزار وارد کنید.
- گزارش تکرار فنی بهجای تکرار زیستی. سه چاهک از یک نمونه فقط دقت پیپتزنی را نشان میدهد، نه تفاوت واقعی بین موجودات یا کشتها.
- صفر گرفتن مقادیر Undetermined. آن چاهک یعنی هدف تا پایان چرخهها آشکار نشده؛ صفر گذاشتن بهجایش نتیجه را بهشدت منحرف میکند. این ابزار چنین چاهکهایی را کنار میگذارد.
- میانگین گرفتن از مقادیر fold بهجای میانگین گرفتن از ΔΔCt. چون رابطه نمایی است، ترتیب این دو عمل نتیجهٔ متفاوتی میدهد.
پرسشهای متداول
بازده تکثیر را چطور بهدست بیاورم؟
یک سری رقت از cDNA بسازید و منحنی استاندارد بکشید. از شیب خط، بازده برابر است با ده به توان منفی یک بر شیب، منهای یک. شیب حدود منفی ۳٫۳۲ یعنی بازده صد درصد.
چند ژن مرجع لازم است؟
برای کار دقیق دستکم دو ژن مرجع توصیه میشود و میانگین هندسیشان استفاده میشود. با یک ژن مرجع، هر نوسانی در همان ژن مستقیم به نتیجهٔ نهایی منتقل میشود.
با Ct بالای ۳۵ چه کنم؟
در آن ناحیه تعداد نسخهٔ اولیه بسیار کم است و پراکندگی بین تکرارها زیاد میشود. حد بالای Ct در این ابزار بهطور پیشفرض روی ۳۸ است؛ اگر دادهتان نویزی است پایینترش بیاورید.
بازهٔ نمایشدادهشده چه معنایی دارد؟
انتشار انحراف معیار تکرارهای فنی ژن هدف و ژن مرجع است. جایگزین آزمون آماری روی تکرارهای زیستی نیست و نباید بهعنوان بازهٔ اطمینان گزارش شود.