پروتئین
غلظت از روی A280
تبدیل جذب به غلظت برای پروتئین و اسید نوکلئیک، با محاسبهٔ ضریب خاموشی از روی توالی و بررسی نسبتهای خلوص.
محاسبه از روی توالی پروتئین
—
برای اسید نوکلئیک از ضریبهای مرسوم استفاده میشود: هر واحد جذب برابر ۵۰ میکروگرم بر میلیلیتر برای DNA دورشتهای، ۳۳ برای تکرشتهای و ۴۰ برای RNA. نسبت ۲۶۰ به ۲۳۰ زیر ۲ نشانهٔ آلودگی با نمک یا فنل است.
فرمول
c = A ÷ (ε × l)
- A
- جذب اندازهگیریشده
- ε
- ضریب خاموشی مولی بر حسب بر مولار بر سانتیمتر
- l
- طول مسیر نوری بر حسب سانتیمتر
- اسید نوکلئیک
- هر واحد جذب برابر ۵۰ میکروگرم بر میلیلیتر برای DNA دورشتهای، ۳۳ برای تکرشته و ۴۰ برای RNA
مثال حلشده
پروتئینی با ضریب خاموشی ۴۳۸۲۴ و وزن ۲۶۹۰۰ دالتون که جذب ۰٫۸۵ میدهد
- A₂₈₀ = 0.85
- ε = 43824 M⁻¹cm⁻¹
- MW = 26900 Da
- l = 1 cm
- غلظت مولی: ۰٫۸۵ تقسیم بر ۴۳۸۲۴ برابر ۱٫۹۴ در ۱۰⁻⁵ مولار
- تبدیل به میکرومولار: ضرب در ۱۰⁶
- غلظت جرمی: ضرب غلظت مولی در وزن مولکولی
پاسخ ۱۹٫۴ میکرومولار، معادل ۰٫۵۲۲ میلیگرم بر میلیلیتر
خطاهای رایج
- فراموش کردن طول مسیر نوری در نانودراپ. این دستگاه معمولاً مسیر ۰٫۱ یا حتی ۰٫۰۳ سانتیمتر دارد و خودش به یک سانتیمتر نرمال میکند؛ اگر عدد خام را بگیرید و دوباره تقسیم کنید، ده برابر خطا میکنید.
- استفاده از قاعدهٔ سرانگشتی «هر واحد جذب برابر یک میلیگرم بر میلیلیتر» برای هر پروتئینی. این فقط برای پروتئینهایی با ترکیب متوسط آروماتیک تقریباً درست است و برای پروتئین کمتریپتوفان بهشدت خطا میدهد.
- نادیده گرفتن آلودگی اسید نوکلئیک. DNA در ۲۸۰ نانومتر هم جذب دارد و غلظت پروتئین را بالاتر از واقع نشان میدهد؛ نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ را نگاه کنید.
- وارد نکردن ضریب رقت وقتی نمونه را قبل از خواندن رقیق کردهاید.
پرسشهای متداول
نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ چه میگوید؟
برای DNA خالص حدود ۱٫۸ و برای RNA حدود ۲٫۰ انتظار میرود. عدد پایینتر نشانهٔ آلودگی پروتئینی یا فنل است. برای پروتئین برعکس، نسبت بالا یعنی آلودگی اسید نوکلئیک.
نسبت ۲۶۰ به ۲۳۰ چرا مهم است؟
زیر ۲ معمولاً یعنی نمک، فنل، کربوهیدرات یا گوانیدین در نمونه مانده. این آلودگیها در واکنشهای بعدی مثل لیگاسیون و ترانسفکشن مزاحمت میکنند حتی وقتی غلظت درست خوانده شده باشد.
اگر پروتئینم تریپتوفان و تیروزین ندارد چه کنم؟
A280 برایتان کار نمیکند. سراغ BCA یا Bradford بروید که به پیوند پپتیدی و باقیماندهٔ بازی حساساند، و منحنی استانداردش را با همین ابزار منحنی استاندارد برازش کنید.