Белки
Концентрация по A280
Перевод поглощения в концентрацию для белков и нуклеиновых кислот, расчёт коэффициента экстинкции по последовательности и проверка отношений чистоты.
Рассчитать по последовательности белка
—
Для нуклеиновых кислот используются общепринятые коэффициенты: одна единица поглощения равна 50 мкг/мл для двухцепочечной ДНК, 33 для одноцепочечной и 40 для РНК. Отношение 260/230 ниже 2 указывает на примеси солей или фенола.
Формула
c = A ÷ (ε × l)
- A
- измеренное поглощение
- ε
- молярный коэффициент экстинкции, М⁻¹·см⁻¹
- l
- длина оптического пути в сантиметрах
- нуклеиновая кислота
- одна единица поглощения — 50 мкг/мл для двухцепочечной ДНК, 33 для одноцепочечной и 40 для РНК
Разобранный пример
Белок с ε 43824 и массой 26900 Да, показание 0,85
- A₂₈₀ = 0,85
- ε = 43824 М⁻¹см⁻¹
- MW = 26900 Да
- l = 1 см
- Молярная концентрация: 0,85 делить на 43824 — это 1,94 × 10⁻⁵ М.
- В микромоли: умножить на 10⁶.
- Массовая концентрация: умножить молярную на молекулярную массу.
Ответ 19,4 мкМ, то есть 0,522 мг/мл
Частые ошибки
- Забыть о длине пути на нанодропе. Он измеряет через 0,1 или даже 0,03 см и сам приводит к 1 см; повторное деление даёт ошибку в десять раз.
- Применять правило «одна единица поглощения — один мг/мл» к любому белку. Оно верно лишь при среднем содержании ароматических остатков и сильно ошибается для белка, бедного триптофаном.
- Игнорировать примесь нуклеиновых кислот. ДНК поглощает и при 280 нм, завышая кажущуюся концентрацию белка; смотрите отношение 260/280.
- Не учитывать коэффициент разведения, если образец разбавляли перед измерением.
Частые вопросы
Что показывает отношение 260/280?
Около 1,8 ожидается для чистой ДНК и около 2,0 для РНК. Меньшее значение указывает на белок или фенол. Для белкового образца логика обратная: высокое отношение означает примесь нуклеиновых кислот.
Почему важно 260/230?
Ниже 2 обычно означает остатки соли, фенола, углеводов или гуанидина. Они мешают последующим лигированию и трансфекции, даже если концентрация измерена верно.
Что делать, если в белке нет триптофана и тирозина?
A280 не подойдёт. Используйте BCA или Брэдфорда, чувствительные к пептидным связям и основным остаткам, а калибровочную кривую постройте инструментом калибровочной кривой.