Protéines
Concentration par A280
Convertir l’absorbance en concentration pour protéines et acides nucléiques, déduire le coefficient d’extinction d’une séquence et vérifier les rapports de pureté.
Déduire d’une séquence protéique
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Les acides nucléiques utilisent les facteurs habituels : une unité d’absorbance vaut 50 µg/ml pour l’ADN double brin, 33 pour le simple brin et 40 pour l’ARN. Un rapport 260/230 inférieur à 2 signale des sels ou du phénol résiduels.
Formule
c = A ÷ (ε × l)
- A
- l’absorbance mesurée
- ε
- coefficient d’extinction molaire, en M⁻¹cm⁻¹
- l
- trajet optique en centimètres
- acide nucléique
- une unité d’absorbance vaut 50 µg/ml pour l’ADN double brin, 33 pour le simple brin et 40 pour l’ARN
Exemple résolu
Une protéine d’ε 43824 et de 26900 Da lisant 0,85
- A₂₈₀ = 0,85
- ε = 43824 M⁻¹cm⁻¹
- MW = 26900 Da
- l = 1 cm
- Concentration molaire : 0,85 divisé par 43824 donne 1,94 × 10⁻⁵ M.
- En micromolaire : multiplier par 10⁶.
- Concentration massique : multiplier la molaire par la masse moléculaire.
Réponse 19,4 µM, soit 0,522 mg/ml
Erreurs courantes
- Oublier le trajet optique sur un NanoDrop. Il mesure sur 0,1 cm voire 0,03 cm et normalise lui-même à 1 cm ; diviser une seconde fois donne une erreur d’un facteur dix.
- Appliquer la règle « une unité d’absorbance vaut un mg/ml » à n’importe quelle protéine. Elle ne tient que pour une composition aromatique moyenne et se trompe lourdement sur une protéine pauvre en tryptophane.
- Négliger la contamination par les acides nucléiques. L’ADN absorbe aussi à 280 nm et gonfle la concentration apparente ; regardez le rapport 260/280.
- Oublier le facteur de dilution quand l’échantillon a été dilué avant lecture.
Questions fréquentes
Que dit le rapport 260/280 ?
On attend environ 1,8 pour de l’ADN propre et environ 2,0 pour de l’ARN. Une valeur plus basse signale des protéines ou du phénol. Pour un échantillon protéique la logique s’inverse : un rapport élevé trahit des acides nucléiques.
Pourquoi le 260/230 compte-t-il ?
En dessous de 2, il reste généralement du sel, du phénol, des sucres ou de la guanidine. Ces résidus gênent la ligature et la transfection en aval, même si la concentration a été bien lue.
Et si ma protéine n’a ni tryptophane ni tyrosine ?
L’A280 ne servira à rien. Passez au BCA ou au Bradford, sensibles aux liaisons peptidiques et aux résidus basiques, et ajustez la courbe étalon avec l’outil dédié.