ماشینحساب
تبدیل ng و pmol
تبدیل مقدار جرمی DNA یا RNA به پیکومول، فمتومول و تعداد کپی، با محاسبهٔ وزن مولکولی از روی طول توالی. برای لیگاسیون، ترانسفورماسیون و آمادهسازی استاندارد qPCR.
وزن مولکولی از میانگین وزن بازها بهدست میآید و برای توالیهای کوتاهتر از حدود صد باز تقریبی است. برای اولیگو، محاسبه بر پایهٔ ترکیب دقیق بازها در ابزار پرایمر خواهد آمد.
فرمول
n (mol) = m (g) ÷ MW (g/mol)
- m
- مقدار جرمی نمونه
- MW
- وزن مولکولی، از طول توالی محاسبه میشود
- dsDNA
- MW ≈ n × ۶۰۷٫۴ + ۱۵۷٫۹
- ssDNA
- MW ≈ n × ۳۰۳٫۷ + ۷۹٫۰
- RNA
- MW ≈ n × ۳۲۰٫۵ + ۱۵۹٫۰
مثال حلشده
پانصد نانوگرم از یک قطعهٔ ۵۰۰۰ جفتبازی چند پیکومول است؟
- m = 500 ng = 5 × 10⁻⁷ g
- n = 5000 bp، دورشتهای
- وزن مولکولی: ۵۰۰۰ × ۶۰۷٫۴ + ۱۵۷٫۹ ≈ ۳٬۰۳۷٬۱۵۸ گرم بر مول
- مول: ۵ × ۱۰⁻⁷ ÷ ۳٬۰۳۷٬۱۵۸ ≈ ۱٫۶۵ × ۱۰⁻¹³ مول
- تبدیل به پیکومول: ضرب در ۱۰¹²
- تعداد کپی: ضرب مول در عدد آووگادرو، ۶٫۰۲۲ × ۱۰²³
پاسخ ۰٫۱۶۵ پیکومول و حدود ۹٫۹ × ۱۰¹⁰ کپی
خطاهای رایج
- استفاده از فرمول دورشتهای برای اولیگو. اولیگونوکلئوتید تکرشته است و وزن مولکولیاش تقریباً نصف حالت دورشتهای؛ انتخاب اشتباه، نتیجه را دو برابر خطا میدهد.
- اعتماد به وزن مولکولی میانگین برای توالیهای خیلی کوتاه. زیر حدود صد باز، ترکیب واقعی بازها اثر محسوسی دارد و محاسبهٔ دقیق باید بر پایهٔ توالی انجام شود.
- وارد کردن طول کل پلاسمید بهجای طول اینسرت، یا برعکس، هنگام محاسبهٔ نسبت مولی برای لیگاسیون.
- فراموش کردن اینکه غلظت خواندهشده با نانودراپ شامل RNA و نوکلئوتیدهای آزاد هم میشود؛ عدد جرمی ورودی باید مربوط به همان قطعهٔ موردنظر باشد.
پرسشهای متداول
نسبت وکتور به اینسرت را چطور حساب کنم؟
مقدار جرمی هر دو را جداگانه به پیکومول تبدیل کنید و سپس نسبت مولی را تنظیم کنید. برای لیگاسیون چسبنده معمولاً نسبت مولی یک به سه وکتور به اینسرت استفاده میشود.
تعداد کپی به چه درد میخورد؟
برای ساختن منحنی استاندارد مطلق در qPCR لازم است. با دانستن تعداد کپی در هر رقت میتوانید تعداد نسخهٔ ژن هدف در نمونهٔ مجهول را برآورد کنید.
برای پلاسمید حلقوی هم همین فرمول درست است؟
بله. وزن مولکولی به تعداد جفتبازها بستگی دارد نه به شکل مولکول، پس فرمول برای پلاسمید حلقوی و قطعهٔ خطی یکسان است.