توالی
پرایمر و Tm
محاسبهٔ دمای ذوب پرایمر با مدل نزدیکترین همسایه و تصحیح نمک و منیزیم، بههمراه بررسی سنجاق سر، خوددایمر، دایمر بین دو پرایمر و پیشنهاد دمای اتصال.
شرایط واکنش
Tm با مدل نزدیکترین همسایه (SantaLucia 1998) و تصحیح نمک محاسبه میشود؛ منیزیم آزاد از تفاضل منیزیم و dNTP بهدست میآید. دمای اتصال پیشنهادی پنج درجه زیر کمترین Tm است و نقطهٔ شروع است، نه جواب نهایی — برای هر جفت پرایمر گرادیان بگیرید.
فرمول
Tm = ΔH° ÷ (ΔS° + R·ln(C_T/4)) − 273.15
- ΔH°
- مجموع آنتالپی جفتبازهای مجاور، کیلوکالری بر مول
- ΔS°
- مجموع آنتروپی، پس از تصحیح نمک
- R
- ثابت جهانی گازها، ۱٫۹۸۷ کالری بر مول کلوین
- C_T
- غلظت کل اولیگو؛ برای پرایمر غیرخودمکمل بر چهار تقسیم میشود
- [Na⁺]eq
- سدیم معادل = سدیم + ۱۲۰ × √(منیزیم − dNTP)
مثال حلشده
پرایمر رفت M13 با توالی GTAAAACGACGGCCAGT در شرایط استاندارد
- طول = 17 نوکلئوتید، GC = 52.9%
- غلظت پرایمر = 250 nM
- [Na⁺] = 50 mM، بدون منیزیم
- برای هر شانزده جفتباز مجاور، آنتالپی و آنتروپی از جدول SantaLucia خوانده و جمع میشود.
- جملهٔ آغازین برای هر دو انتها اضافه میشود؛ انتهای G یا C سهم متفاوتی از A یا T دارد.
- آنتروپی با ۰٫۳۶۸ × (طول − ۱) × ln([Na⁺]eq) تصحیح میشود.
- مقادیر در رابطهٔ بالا گذاشته و از کلوین به سلسیوس تبدیل میشود.
پاسخ حدود ۵۱٫۷ درجه — در حالی که فرمول سادهٔ ۴+۲ عدد ۴۷٫۱ میدهد
خطاهای رایج
- استفاده از فرمول سادهٔ ۲(A+T) + ۴(G+C) برای پرایمرهای بلندتر از سیزده نوکلئوتید. آن فرمول برای اولیگوهای کوتاه و شرایط خاص ساخته شده و برای پرایمر PCR اختلاف چند درجهای میدهد.
- وارد نکردن منیزیم. منیزیم بار منفی اسکلت فسفاته را خنثی میکند و Tm را چند درجه بالا میبرد؛ نادیده گرفتنش یعنی دمای اتصال را دستکم گرفتهاید.
- اختلاف زیاد Tm بین دو پرایمر جفت. اگر اختلاف از سه درجه بگذرد، در یک دمای اتصال یکی بهخوبی متصل نمیشود و دیگری غیراختصاصی میچسبد.
- گذاشتن بیش از سه G یا C در پنج باز انتهای ۳ پریم. اتصال انتهای ۳ پریم بیش از حد پایدار میشود و اتصال غیراختصاصی را تثبیت میکند.
- برابر گرفتن دمای اتصال با Tm. دمای اتصال معمولاً پنج درجه پایینتر گرفته میشود و برای هر جفت پرایمر تازه باید با گرادیان بهینه شود.
پرسشهای متداول
چرا دو عدد Tm متفاوت نشان داده میشود؟
ستون نزدیکترین همسایه بر پایهٔ ترمودینامیک جفتبازهای مجاور و شرایط واقعی واکنش محاسبه میشود و دقیقتر است. ستون فرمول ساده فقط برای مقایسه با پروتکلهای قدیمی و مقالاتی که همان را گزارش کردهاند نگه داشته شده.
سنجاق سر چقدر مسئلهساز است؟
ساقهٔ کوتاهتر از چهار باز معمولاً در دمای اتصال باز میشود و اهمیتی ندارد. ساقهٔ پنج باز یا بیشتر، بهویژه اگر نزدیک انتهای ۳ پریم باشد، بازده تکثیر را محسوس پایین میآورد.
برای پرایمری که دنبالهٔ اضافه دارد چه کنم؟
در چرخههای اول فقط بخشی که با الگو جفت میشود متصل است، پس Tm را برای همان بخش حساب کنید. جایگاه برشی یا تگ اضافهشده از چرخهٔ سوم به بعد در محصول وارد میشود و Tm واقعی را بالا میبرد.