Séquences
Amorces et Tm
Température de fusion selon le modèle des plus proches voisins avec correction saline et magnésium, plus les contrôles d’épingle, d’auto-dimère et de dimère d’amorces et une température d’hybridation suggérée.
Conditions de réaction
La Tm suit le modèle des plus proches voisins (SantaLucia 1998) avec correction saline ; le magnésium libre vaut le magnésium moins les dNTP. La température d’hybridation suggérée se situe cinq degrés sous la Tm la plus basse : c’est un point de départ, pas une réponse — faites un gradient pour chaque nouvelle paire.
Formule
Tm = ΔH° ÷ (ΔS° + R·ln(C_T/4)) − 273,15
- ΔH°
- somme des enthalpies des paires voisines, kcal/mol
- ΔS°
- somme des entropies, après correction saline
- R
- constante des gaz, 1,987 cal/mol·K
- C_T
- concentration totale en oligo ; divisée par quatre pour une amorce non auto-complémentaire
- [Na⁺]éq
- sodium équivalent = sodium + 120 × √(magnésium − dNTP)
Exemple résolu
L’amorce sens M13 GTAAAACGACGGCCAGT en conditions standard
- longueur = 17 nt, GC = 52,9 %
- concentration d’amorce = 250 nM
- [Na⁺] = 50 mM, sans magnésium
- Pour chacune des seize paires voisines, enthalpie et entropie sont lues dans la table de SantaLucia puis sommées.
- Un terme d’initiation est ajouté aux deux extrémités ; une extrémité G ou C ne contribue pas comme une extrémité A ou T.
- L’entropie est corrigée de 0,368 × (longueur − 1) × ln([Na⁺]éq).
- Les valeurs entrent dans l’équation ci-dessus et les kelvins sont convertis en degrés Celsius.
Réponse environ 51,7 °C — là où la règle simple 4+2 donne 47,1 °C
Erreurs courantes
- Appliquer 2(A+T) + 4(G+C) à des amorces de plus de treize nucléotides. Cette règle vise les oligos courts et se trompe de plusieurs degrés sur des amorces de PCR.
- Omettre le magnésium. Il écrante le squelette phosphate et relève la Tm de plusieurs degrés ; l’ignorer revient à sous-estimer la température d’hybridation.
- Un écart de Tm important entre les deux amorces. Au-delà d’environ trois degrés, l’une s’hybride mal à une température commune tandis que l’autre s’apparie de façon non spécifique.
- Plus de trois G ou C dans les cinq dernières bases en 3′. L’extrémité devient trop stable et verrouille les amorçages non spécifiques.
- Confondre température d’hybridation et Tm. On la fixe en général cinq degrés plus bas, et chaque nouvelle paire mérite un gradient.
Questions fréquentes
Pourquoi deux valeurs de Tm différentes ?
La colonne plus proches voisins s’appuie sur la thermodynamique des paires voisines et sur vos conditions réelles : c’est la valeur exacte. La colonne formule simple n’est là que pour comparer avec les protocoles anciens et les articles qui la citent.
Une épingle à cheveux, est-ce grave ?
Une tige de moins de quatre bases fond à la température d’hybridation et peut être ignorée. À partir de cinq bases, surtout près de l’extrémité 3′, l’efficacité d’amplification baisse nettement.
Et une amorce avec une queue ajoutée ?
Lors des premiers cycles, seule la partie complémentaire de la matrice s’hybride : calculez la Tm sur cette partie. Le site de restriction ou l’étiquette entre dans le produit dès le troisième cycle et relève la Tm effective.