توالی
جایگاههای برشی
یافتن جایگاههای برش آنزیمهای محدودکننده روی توالی خطی یا حلقوی، با هضم مجازی، فیلتر نوع انتها، پشتیبانی از آنزیمهای نوع IIS و ژل شبیهسازیشده.
آنزیمهای برشدهنده
هیچ جایگاه برشی با این تنظیمات پیدا نشد.
ژل شبیهسازیشده
موقعیتها از ۱ شمرده میشوند و به ابتدای جایگاه شناسایی اشاره دارند. برای آنزیمهای نوع IIS، عدد داخل پرانتز فاصلهٔ برش از انتهای جایگاه است. حساسیت به متیلاسیون در نظر گرفته نشده.
فرمول
EcoRI: G^AATTC → انتهای چسبندهٔ چهار بازی در جهت پنج پریم
- ^
- محل برش روی رشتهٔ بالا
- عدد داخل پرانتز
- اختلاف محل برش دو رشته؛ مثبت یعنی دنبالهٔ پنج پریم
- نوع IIS
- مثل GGTCTC(1/5) که بیرون از جایگاه شناسایی برش میزند
مثال حلشده
انتخاب آنزیم برای همسانهسازی جهتدار در یک وکتور
- اینسرت و وکتور هر دو باید با دو آنزیم متفاوت بریده شوند
- حالت «فقط برشهای یکتا» را انتخاب کنید تا آنزیمهایی که بیش از یک بار میبرند حذف شوند.
- دو آنزیم با انتهای چسبندهٔ متفاوت انتخاب کنید تا اینسرت فقط در یک جهت وارد شود.
- مطمئن شوید هیچکدام داخل خود اینسرت جایگاه ندارند.
پاسخ یک جفت آنزیم که هرکدام دقیقاً یک بار و در ناحیهٔ چندهمسانهسازی میبرند
خطاهای رایج
- فراموش کردن حساسیت به متیلاسیون. سیستم Dam و Dcm در E. coli جایگاه آنزیمهایی مثل XbaI و ClaI را متیله و برش را مسدود میکند؛ این ابزار متیلاسیون را مدل نمیکند.
- در نظر نگرفتن حلقوی بودن پلاسمید. اگر گزینهٔ حلقوی را نزنید، جایگاههایی که روی نقطهٔ اتصال ابتدا و انتها قرار دارند دیده نمیشوند.
- طراحی پرایمر با جایگاه برشی در انتها بدون افزودن چند باز اضافه. بیشتر آنزیمها نمیتوانند جایگاهی را که درست در لبهٔ قطعه است ببرند؛ معمولاً سه تا شش باز اضافه لازم است.
پرسشهای متداول
چرا موقعیتها با نرمافزار دیگری فرق دارد؟
در این ابزار موقعیت از یک شمرده میشود و به ابتدای جایگاه شناسایی اشاره دارد، نه به محل برش. بعضی نرمافزارها محل برش را گزارش میکنند که چند باز جلوتر است.
آنزیم نوع IIS به چه درد میخورد؟
چون بیرون از جایگاه شناسایی میبرد، انتهای چسبندهٔ دلخواه میسازد و جایگاه شناسایی در محصول نهایی باقی نمیماند. پایهٔ روشهای Golden Gate و MoClo همین است.