Последовательности
Праймеры и Tm
Температура плавления по модели ближайших соседей с поправкой на соль и магний, а также проверка шпилек, самодимеров и димеров пары и рекомендация температуры отжига.
Условия реакции
Tm рассчитывается по модели ближайших соседей (SantaLucia, 1998) с поправкой на соль; свободный магний равен магнию за вычетом dNTP. Рекомендуемая температура отжига на пять градусов ниже меньшей Tm — это отправная точка, а не ответ: для каждой новой пары ставьте градиент.
Формула
Tm = ΔH° ÷ (ΔS° + R·ln(C_T/4)) − 273,15
- ΔH°
- сумма энтальпий соседних пар оснований, ккал/моль
- ΔS°
- сумма энтропий после солевой поправки
- R
- газовая постоянная, 1,987 кал/моль·К
- C_T
- суммарная концентрация олигонуклеотида; для несамокомплементарного праймера делится на четыре
- [Na⁺]экв
- эквивалент натрия = натрий + 120 × √(магний − dNTP)
Разобранный пример
Прямой праймер M13 GTAAAACGACGGCCAGT в стандартных условиях
- длина = 17 н., GC = 52,9%
- концентрация праймера = 250 нМ
- [Na⁺] = 50 мМ, без магния
- Для каждой из шестнадцати соседних пар энтальпия и энтропия берутся из таблицы Санта-Лючии и суммируются.
- Для обоих концов добавляется инициирующий член; конец G или C вносит иной вклад, чем A или T.
- Энтропия корректируется на 0,368 × (длина − 1) × ln([Na⁺]экв).
- Значения подставляются в формулу, кельвины переводятся в градусы Цельсия.
Ответ около 51,7 °C — тогда как простое правило 4+2 даёт 47,1 °C
Частые ошибки
- Применение правила 2(A+T) + 4(G+C) к праймерам длиннее тринадцати нуклеотидов. Оно выведено для коротких олигонуклеотидов и для праймеров ПЦР ошибается на несколько градусов.
- Игнорирование магния. Магний экранирует отрицательный фосфатный остов и поднимает Tm на несколько градусов; без него температура отжига окажется заниженной.
- Большой разрыв Tm между праймерами пары. Свыше примерно трёх градусов один праймер при общей температуре отжига садится плохо, а второй — неспецифично.
- Более трёх G или C в последних пяти основаниях с 3′-конца. Конец становится слишком стабильным и закрепляет неспецифичную посадку.
- Приравнивание температуры отжига к Tm. Обычно её берут примерно на пять градусов ниже, и для каждой новой пары стоит поставить градиент.
Частые вопросы
Почему показаны два разных значения Tm?
Колонка ближайших соседей учитывает термодинамику соседних пар и реальные условия реакции — она точная. Колонка простой формулы оставлена лишь для сравнения со старыми протоколами и статьями.
Насколько мешает шпилька?
Стебель короче четырёх оснований обычно плавится при температуре отжига и не важен. Пять и более, особенно вблизи 3′-конца, заметно снижают эффективность амплификации.
Что делать с праймером с добавленным хвостом?
В первых циклах садится только часть, комплементарная матрице, поэтому считайте Tm для неё. Сайт рестрикции или метка входят в продукт с третьего цикла и повышают фактическую Tm.