وکتور
کلونینگ مجازی
شبیهسازی برش با آنزیم محدودکننده و اتصال، محاسبهٔ اندازهٔ سازهٔ نهایی، انتقال ویژگیها و بررسی همقاب ماندن با تگهای وکتور.
بررسی چارچوب خواندن
—
نقشهٔ سازهٔ نهایی
شبیهسازی فرض میکند هضم کامل انجام شده و اتصال بدون خطا صورت گرفته است. حساسیت به متیلاسیون، دفسفریلاسیون وکتور و بازده اتصال مدل نمیشوند. ویژگیهایی که روی محل برش میافتند به سازهٔ نهایی منتقل نمیشوند، چون مختصاتشان دیگر معنا ندارد.
فرمول
سازه = اسکلت وکتور + قطعهٔ اینسرت
- اسکلت
- بخشی از وکتور که بین دو محل برش نیست و نگه داشته میشود
- قطعهٔ حذفشده
- بخشی از وکتور که بین دو برش است و بیرون میرود
- قطعهٔ اینسرت
- بخشی از اینسرت که بین دو محل برش خودش است
- دنباله
- انتهای تکرشتهای که آنزیم میسازد؛ برای اتصال باید مکمل هم باشند
مثال حلشده
کلونینگ جهتدار یک قطعهٔ ۳۰۰ بازی با EcoRI و HindIII
- وکتور حلقوی ۵۱۲ باز، با EcoRI در موقعیت ۲۰۱ و HindIII در ۲۶۷
- اینسرت با EcoRI در موقعیت ۱۱ و HindIII در ۳۱۷
- قطعهٔ حذفشده از وکتور برابر فاصلهٔ دو برش است: ۲۶۷ منهای ۲۰۱ یعنی ۶۶ باز.
- اسکلت باقیمانده: ۵۱۲ منهای ۶۶ یعنی ۴۴۶ باز.
- قطعهٔ اینسرت: ۳۱۷ منهای ۱۱ یعنی ۳۰۶ باز.
- سازهٔ نهایی: ۴۴۶ بهعلاوهٔ ۳۰۶.
پاسخ سازهٔ حلقوی ۷۵۲ بازی، با هر دو جایگاه برشی بازسازیشده در محل اتصال
خطاهای رایج
- انتخاب دو آنزیم با دنبالهٔ یکسان برای کلونینگ جهتدار. مثلاً BamHI و BglII دنبالهٔ GATC میسازند؛ اینسرت در هر دو جهت وارد میشود و وکتور میتواند خودبهخود ببندد. ابزار در این حالت هشدار میدهد.
- فراموش کردن اینکه جایگاه برشی در انتهای پرایمر باید چند باز اضافه داشته باشد. بیشتر آنزیمها جایگاهی را که درست در لبهٔ قطعه است نمیبرند، پس سه تا شش باز پوشش لازم است.
- در نظر نگرفتن اینکه خودِ جایگاه برشی در سازهٔ نهایی ترجمه میشود. جایگاه EcoRI شش باز است، یعنی دو کدون اضافه در پروتئین فیوژن — و اگر مضرب سه نباشد، همهچیز از قاب خارج میشود.
- اعتماد به شبیهسازی بهجای بررسی متیلاسیون. سیستم Dam و Dcm در E. coli جایگاه آنزیمهایی مثل XbaI و ClaI را مسدود میکند و این ابزار متیلاسیون را مدل نمیکند.
پرسشهای متداول
بررسی همقاب بودن دقیقاً چه چیزی را میگوید؟
سه چیز: آیا اتصال ۵ پریم با مبدأ ترجمه همقاب است، آیا ترجمه بدون برخورد به کدون پایان از اینسرت عبور میکند، و آیا اتصال ۳ پریم برای تگ انتهای C همقاب مانده. این سه دقیقاً همان شکستهاییاند که معمولاً بعد از توالییابی کشف میشوند.
با یک آنزیم هم میشود کلون کرد؟
بله. وکتور باید یک جایگاه داشته باشد تا خطی شود و اینسرت دو جایگاه تا قطعه آزاد شود. ولی چون هر دو انتها دنبالهٔ یکسان دارند، جهتگیری تصادفی است و باید بعداً با هضم تشخیصی بررسی شود.
چرا بعضی ویژگیها به سازهٔ نهایی منتقل نشدند؟
ویژگیهایی که روی محل برش میافتند نصف میشوند و مختصاتشان در سازهٔ جدید معنایی ندارد، پس عمداً حذف و تعدادشان گزارش میشود.
نسبت وکتور به اینسرت را از کجا بیاورم؟
اندازههای محاسبهشده در همین صفحه را در ابزار تبدیل نانوگرم به پیکومول بگذارید تا مقدار جرمی لازم برای نسبت مولی موردنظرتان بهدست بیاید.