Векторы
Виртуальное клонирование
Моделирование гидролиза рестриктазами и лигирования: размер конструкции, перенос элементов и проверка того, что слияние остаётся в рамке с метками вектора.
Проверка рамки считывания
—
Карта конструкции
Моделирование предполагает полный гидролиз и безошибочное лигирование. Чувствительность к метилированию, дефосфорилирование вектора и эффективность лигирования не учитываются. Элементы, попавшие на сайт разреза, в конструкцию не переносятся, так как их координаты теряют смысл.
Формула
конструкция = остов вектора + фрагмент вставки
- остов
- часть вектора вне двух разрезов, которая сохраняется
- удалённый фрагмент
- часть вектора между двумя разрезами, которая отбрасывается
- фрагмент вставки
- часть вставки между её собственными двумя разрезами
- выступ
- одноцепочечный конец, оставляемый ферментом; для лигирования концы должны быть комплементарны
Разобранный пример
Направленное клонирование фрагмента в 300 п.н. с EcoRI и HindIII
- кольцевой вектор 512 п.н., EcoRI режет в позиции 201, HindIII — в 267
- вставка: EcoRI режет в позиции 11, HindIII — в 317
- Удаляемый из вектора фрагмент равен расстоянию между разрезами: 267 минус 201, то есть 66 п.н.
- Остающийся остов: 512 минус 66, то есть 446 п.н.
- Фрагмент вставки: 317 минус 11, то есть 306 п.н.
- Конструкция: 446 плюс 306.
Ответ кольцевая конструкция 752 п.н., оба сайта рестрикции восстановлены на стыках
Частые ошибки
- Выбор двух ферментов с одинаковым выступом для направленного клонирования. BamHI и BglII оба оставляют GATC, поэтому вставка встанет в любой ориентации, а вектор может замкнуться сам. Инструмент в этом случае предупреждает.
- Забывают, что сайт рестрикции на конце праймера требует запаса оснований. Большинство ферментов не режут сайт вплотную к краю фрагмента, нужно три-шесть дополнительных оснований.
- Упускают, что сам сайт рестрикции транслируется в конструкции. Сайт EcoRI — шесть оснований, то есть два лишних кодона в слитом белке; и если сумма не кратна трём, всё ниже по течению уходит из рамки.
- Полагаться на моделирование вместо проверки метилирования. Метилирование Dam и Dcm в E. coli блокирует такие ферменты, как XbaI и ClaI, а инструмент этого не учитывает.
Частые вопросы
Что именно показывает проверка рамки?
Три вещи: находится ли 5′-стык в рамке с началом трансляции, проходит ли трансляция вставку без стоп-кодона и остаётся ли 3′-стык в рамке для C-концевой метки. Именно эти три сбоя обычно обнаруживаются лишь после секвенирования.
Можно ли клонировать одним ферментом?
Да. Вектору нужен один сайт, чтобы он линеаризовался, а вставке — два, чтобы фрагмент высвободился. Поскольку оба конца несут одинаковый выступ, ориентация случайна и её нужно проверить диагностическим гидролизом.
Почему часть элементов не перенеслась в конструкцию?
Элементы, попавшие на сайт разреза, оказываются рассечёнными, и их координаты в новой молекуле лишены смысла, поэтому они намеренно отбрасываются с подсчётом.
Как подобрать соотношение вектор : вставка?
Возьмите рассчитанные здесь размеры в инструмент перевода нанограммов в пикомоли и получите массы для нужного молярного соотношения.