Vecteurs
Clonage virtuel
Simuler une digestion par enzymes de restriction et une ligature, dimensionner la construction, reporter les éléments et vérifier que la fusion reste dans le cadre des étiquettes du vecteur.
Vérification du cadre de lecture
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Carte de la construction
La simulation suppose une digestion complète et une ligature sans erreur. La sensibilité à la méthylation, la déphosphorylation du vecteur et le rendement de ligature ne sont pas modélisés. Les éléments à cheval sur un site de coupure ne sont pas reportés, leurs coordonnées n’ayant plus de sens.
Formule
construction = squelette du vecteur + fragment d’insert
- squelette
- la part du vecteur hors des deux coupures, qui est conservée
- fragment retiré
- la part du vecteur entre les deux coupures, qui est éliminée
- fragment d’insert
- la part de l’insert entre ses deux propres coupures
- extrémité sortante
- le bout simple brin laissé par l’enzyme ; les bouts doivent être complémentaires pour se liguer
Exemple résolu
Clonage orienté d’un fragment de 300 pb avec EcoRI et HindIII
- vecteur circulaire de 512 pb, EcoRI coupant en 201 et HindIII en 267
- insert avec EcoRI coupant en 11 et HindIII en 317
- Le fragment retiré du vecteur vaut l’écart entre les coupures : 267 moins 201, soit 66 pb.
- Le squelette restant : 512 moins 66, soit 446 pb.
- Le fragment d’insert : 317 moins 11, soit 306 pb.
- La construction : 446 plus 306.
Réponse une construction circulaire de 752 pb, les deux sites de restriction étant recréés aux jonctions
Erreurs courantes
- Choisir deux enzymes au même bout sortant pour un clonage orienté. BamHI et BglII laissent tous deux GATC : l’insert entre dans les deux sens et le vecteur peut se refermer. L’outil avertit dans ce cas.
- Oublier qu’un site de restriction en bout d’amorce demande des bases de marge. La plupart des enzymes ne coupent pas un site affleurant l’extrémité : trois à six bases sont nécessaires.
- Négliger le fait que le site de restriction lui-même est traduit dans la construction. Un site EcoRI fait six bases, soit deux codons de plus dans la protéine de fusion ; et si le total n’est pas un multiple de trois, tout l’aval sort du cadre.
- Se fier à la simulation au lieu de vérifier la méthylation. Les méthylations Dam et Dcm d’E. coli bloquent des enzymes comme XbaI et ClaI, ce que l’outil ne modélise pas.
Questions fréquentes
Que dit exactement la vérification du cadre ?
Trois choses : si la jonction 5′ est dans le cadre du début de traduction, si la traduction traverse l’insert sans rencontrer de codon stop, et si la jonction 3′ reste dans le cadre pour une étiquette C-terminale. Ce sont les trois échecs que l’on découvre d’ordinaire seulement après séquençage.
Peut-on cloner avec une seule enzyme ?
Oui. Le vecteur doit avoir un site pour être linéarisé, et l’insert deux pour libérer le fragment. Les deux extrémités portant le même bout, l’orientation est aléatoire et se vérifie ensuite par digestion diagnostique.
Pourquoi certains éléments ne sont-ils pas reportés ?
Les éléments à cheval sur un site de coupure sont sectionnés et leurs coordonnées n’auraient plus de sens dans la nouvelle molécule : ils sont donc écartés et comptés.
Comment fixer le rapport vecteur/insert ?
Reportez les tailles calculées ici dans l’outil ng vers pmol pour obtenir les masses correspondant au rapport molaire voulu.