Analyse
Courbe étalon
Ajuster une courbe étalon par un modèle linéaire ou à quatre paramètres et y lire les concentrations inconnues, pour ELISA, Bradford, BCA et qPCR.
Étalons
Échantillons inconnus
Les données ELISA s’ajustent en général mieux avec le modèle à quatre paramètres sur un axe logarithmique, les deux extrémités de la courbe saturant. Les échantillons marqués d’un astérisque ont un signal hors plage : leur concentration est extrapolée.
Formule
y = D + (A − D) ÷ (1 + (x ÷ C)^B)
- A
- l’asymptote haute, le signal à concentration infinie
- D
- l’asymptote basse, le signal à zéro
- C
- la concentration à mi-chemin entre les asymptotes — l’EC50
- B
- la pente de la courbe en ce point médian
Exemple résolu
Pourquoi une droite fausse les données d’ELISA
- étalons de 0,1 à 30 ng/ml
- signal saturant entre 0,12 et 2,05
- Aux faibles concentrations la courbe est presque droite et l’ajustement linéaire convient.
- Aux fortes concentrations le signal plafonne et la pente tend vers zéro.
- Une droite ne voit pas cette saturation et sous-estime les échantillons à fort signal.
- Le modèle à quatre paramètres décrit les deux extrémités et donne un R² proche de un.
Réponse quatre paramètres sur axe logarithmique pour des données sigmoïdes, linéaire dans la plage droite
Erreurs courantes
- Extrapoler au-delà des étalons. Un échantillon au-dessus du plus haut étalon doit être dilué et relu, non lu sur une courbe prolongée. L’outil marque ces échantillons d’un astérisque.
- Se fier au seul R². Une sigmoïde ajustée par une droite peut afficher un R² supérieur à 0,95 tout en étant fausse aux deux bouts ; regardez les résidus, pas seulement le coefficient.
- Oublier de soustraire le blanc. Sans cela l’asymptote basse ne tombe pas à zéro et toutes les faibles concentrations ressortent trop hautes.
- Forcer la courbe par l’origine. Le bruit de fond d’un ELISA n’est jamais nul et cette contrainte introduit une erreur systématique.
Questions fréquentes
Quel modèle choisir ?
Si les points dessinent un S aux extrémités plates, le modèle à quatre paramètres. Si vous n’avez couvert que la partie droite médiane, le linéaire est plus simple et plus stable.
Que représente le paramètre C ?
La concentration où le signal se situe exactement à mi-chemin des asymptotes. En format compétitif c’est l’IC50 ; en format direct, une mesure de la sensibilité du dosage.
Combien d’étalons faut-il ?
Au moins trois pour un ajustement linéaire, cinq de préférence. Le modèle à quatre paramètres en estime quatre et réclame au moins six points, faute de quoi l’ajustement devient instable.