Анализ
Калибровочная кривая
Аппроксимация калибровочной кривой линейной или четырёхпараметрической моделью и расчёт концентраций неизвестных образцов для ИФА, Брэдфорда, BCA и qPCR.
Стандарты
Неизвестные образцы
Данные ИФА обычно лучше описываются четырёхпараметрической моделью на логарифмической оси, так как оба конца кривой насыщаются. У образцов со звёздочкой сигнал вне диапазона стандартов, и концентрация получена экстраполяцией.
Формула
y = D + (A − D) ÷ (1 + (x ÷ C)^B)
- A
- верхняя асимптота, сигнал при бесконечной концентрации
- D
- нижняя асимптота, сигнал при нуле
- C
- концентрация ровно посередине между асимптотами — EC50
- B
- наклон кривой в этой средней точке
Разобранный пример
Почему прямая искажает данные ИФА
- стандарты от 0,1 до 30 нг/мл
- сигнал насыщается между 0,12 и 2,05
- При низких концентрациях кривая почти прямая, и линейная аппроксимация работает.
- При высоких сигнал упирается в потолок, наклон уходит в нуль.
- Прямая этого насыщения не видит и занижает образцы с сильным сигналом.
- Четырёхпараметрическая модель описывает оба конца и даёт R² около единицы.
Ответ для сигмоидных данных — четыре параметра на логарифмической оси, в пределах линейного участка — линейная
Частые ошибки
- Экстраполяция за пределы стандартов. Образец выше верхнего стандарта следует развести и измерить заново, а не считывать с продолженной кривой. Инструмент помечает такие образцы звёздочкой.
- Доверять одному лишь R². Сигмоида, аппроксимированная прямой, может дать R² выше 0,95, будучи грубо неверной на обоих концах; смотрите на остатки, а не только на коэффициент.
- Забыть вычесть бланк. Без этого нижняя асимптота оказывается не в нуле, и все низкие концентрации завышаются.
- Принудительно проводить кривую через начало координат. Фоновый сигнал в ИФА никогда не равен нулю, и такое принуждение вносит систематическую ошибку.
Частые вопросы
Какую модель выбрать?
Если точки образуют S с плоскими концами — четырёхпараметрическую. Если охвачен только прямой средний участок, линейная проще и устойчивее.
Что означает параметр C?
Концентрацию, при которой сигнал находится точно посередине между асимптотами. В конкурентном формате это IC50, в прямом — мера чувствительности метода.
Сколько нужно стандартов?
Для линейной аппроксимации минимум три, лучше пять. Четырёхпараметрическая модель оценивает четыре параметра, и ей нужно не менее шести точек, иначе аппроксимация неустойчива.